他の天台門跡寺院と同様、最澄（767-822）の時代に比叡山上に草創された坊（小寺院）がその起源とされる。その後、12世紀頃に北山（現在の京都市右京区・鹿苑寺付近）に本拠を移し、洛中（現在の京都市上京区・相国寺付近）への移転を経て、現在地に移転したのは明暦2年（1656年）のことである。
寺伝では延暦年間（782-806）、伝教大師最澄が比叡山上に営んだ一坊がその起源とされる。円仁、安恵らを経て、天暦年間（947 - 957年）、是算国師の時、比叡山三塔のうちの西塔北谷に移り、東尾坊（とうびぼう）と称したという。曼殊院ではこの是算を初代としている。
曼殊院は平安時代以来、近世末期に至るまで北野神社（現・北野天満宮）と関係が深かった。歴代の曼殊院門主は北野神社の別当（管理責任者）を兼ねており、前述の是算が菅原氏の出身であったことから、菅原道真を祭神とする神社である北野神社の初代別当になったという。是算の北野別当就任時期については、北野神社創建時（天暦元年・947年）とする説と、創建時ではなく、寛弘元年（1004年）、一条天皇の北野神社行幸時のこととする説がある。『華頂要略』所収の「諸門跡伝」は是算の没年を寛仁2年（1018年）としており、この没年からみて、それより70年以上前の天暦元年（947年）の北野別当就任は不自然だとする研究者もいる
天仁年間（1108-1110）、是算から数えて8代目の門主・忠尋の時に、北野神社からさほど遠くない北山（現・京都市右京区）に別院を建て、寺号を「曼殊院」と改めた。別院を建設したのは、北野神社の管理の便のためと思われる。比叡山にある本坊と北山の別院とはしばらくの間、並立していたが、次第に北山の別院が主体となっていった。
北山にあった曼殊院は、足利義満の北山殿（後の鹿苑寺）造営のため移転を余儀なくされ、康暦年間（1379-1381）、洛中に移転する。移転先は相国寺の南方、現在の京都市上京区内に相当する。
明応4年（1495年）頃、伏見宮貞常親王の息で後土御門天皇の猶子である大僧正慈運法親王が26世門主として入寺して以降、曼殊院は代々皇族が門主を務めることが慣例となり、宮門跡としての地位が確立した。
曼殊院を東山山麓の現在地に移し、寺観を整えたのは29世門主の良尚法親王であった（法親王とは皇族男子で出家後に親王宣下を受けた者の称である）。曼殊院の現在地への移転は明暦2年（1656年）のことで、現存する大書院（本堂）、小書院などはこの時のものである。この地は曼殊院と同じく比叡山の小坊の1つで慶滋保胤らによって勧学会が開かれたものの後に廃絶した月林寺の跡地であったと言われている。
良尚法親王は桂離宮を造営したことで名高い八条宮智仁親王の第二皇子であり、後水尾天皇の猶子であった。良尚法親王は天台座主（天台宗最高の地位）を務めた仏教者であると共に茶道、華道、香道、和歌、書道、造園などに通じた教養人であり、当代文化に与えた影響は大きかった。曼殊院に伝存する茶室、古今伝授資料（古今和歌集の秘伝を相承するための資料）、立花図（池坊流2世池坊専好の立花をスケッチしたもの）などの文化財は法親王の趣味と教養の広さを示している。 | 
